Флуоресцентті сүзгі флуоресцентті микроскоптың маңызды құрамдас бөлігі болып табылады. Әдеттегі жүйеде үш негізгі сүзгі бар: қоздыру сүзгісі, эмиссия сүзгісі және дихроикалық айна. Олар әдетте текшеге оралған, осылайша топ бірге микроскопқа енгізіледі.
Флуоресцентті сүзгі қалай жұмыс істейді?
Қозу сүзгісі
Қоздыру сүзгілері белгілі бір толқын ұзындығының сәулесін өткізеді және басқа толқын ұзындығын блоктайды. Оларды тек бір түсті өткізуге мүмкіндік беретін сүзгіні реттеу арқылы әртүрлі түстерді шығару үшін пайдалануға болады. Қоздыру сүзгілері екі негізгі түрге бөлінеді - ұзын өту сүзгілері және жолақты сүзгілер. Қоздырғыш әдетте флуофор жұтқан толқын ұзындықтарын ғана өткізетін жолақты сүзгі болып табылады, осылайша флуоресценцияның басқа көздерінің қозуын азайтады және флуоресценцияның эмиссия диапазонында қозу жарығын блоктайды. Суреттегі көк сызықпен көрсетілгендей, BP 460-495, яғни ол тек 460-495нм флуоресценция арқылы өте алады.
Ол флуоресцентті микроскоптың жарықтандыру жолына орналастырылады және флюорофор қозу диапазонынан басқа жарық көзінің барлық толқын ұзындығын сүзеді. Сүзгі ең аз тасымалдау кескіндердің жарықтығы мен жарқырауын белгілейді. Кез келген қоздыру сүзгісі үшін кем дегенде 40% беріліс ұсынылады, осылайша беріліс мінсіз >85% болады. Қоздыру сүзгісінің өткізу жолағы толығымен сүзгінің орталық толқын ұзындығы (CWL) флюорофордың қозу толқынының ең жоғары ұзындығына жақын болуы үшін толығымен флюорофор қозу диапазонында болуы керек. Қозу сүзгісінің оптикалық тығыздығы (OD) фондық кескіннің қараңғылығын белгілейді; OD – сүзгінің жіберу ауқымынан немесе өткізу жолағынан тыс толқын ұзындығын қаншалықты жақсы блоктайтынының өлшемі. Ең аз OD 3,0 ұсынылады, бірақ OD 6,0 немесе одан жоғары болуы өте қолайлы.
Эмиссия сүзгісі
Эмиссия сүзгілері үлгідегі қажетті флуоресценцияның детекторға жетуіне мүмкіндік беру мақсатына қызмет етеді. Олар қысқа толқын ұзындығын блоктайды және ұзағырақ толқын ұзындығы үшін жоғары өткізгіштікке ие. Сүзгі түрі сондай-ақ санмен байланысты, мысалы, суреттегі BA510IF (кедергілер тосқауылының сүзгісі), бұл белгілеу оның максималды өткізуінің 50% толқын ұзындығына жатады.
Қоздыру сүзгілеріне арналған бірдей ұсыныстар эмиссия сүзгілеріне де қатысты: ең аз тасымалдау, өткізу қабілеттілігі, OD және CWL. Ең жақсы CWL, ең аз беріліс және OD комбинациясы бар эмиссия сүзгісі барынша терең блоктаумен мүмкін болатын ең жарқын кескіндерді қамтамасыз етеді және ең әлсіз эмиссия сигналдарын анықтауды қамтамасыз етеді.
Дихрикалық айна
Дихроикалық айна қоздыру сүзгісі мен эмиссия сүзгісінің арасына 45° бұрышпен орналастырылған және эмиссиялық сигналды детекторға жіберген кезде қозу сигналын флюорофорға қарай көрсетеді. Идеалды дихрионды сүзгілер мен сәуле бөлгіштер қоздыру сүзгісінің өткізу жолағы үшін >95% шағылысу және эмиссия сүзгісінің өткізу қабілеттілігі үшін >90% шағылысатын максималды шағылысу мен максималды беру арасында күрт ауысуларға ие. Қатаған жарықты азайту және флуоресцентті кескін сигналының шуылға қатынасын барынша арттыру үшін флюорофордың қиылысу толқын ұзындығын (λ) ескере отырып сүзгіні таңдаңыз.
Бұл суреттегі дихриондық айна DM505 болып табылады, сондықтан 505 нанометр толқын ұзындығы осы айна үшін максималды берудің 50% құрайды. Бұл айна үшін беріліс қисығы 505 нм-ден жоғары жоғары өткізуді, 505 нанометрден солға қарай жіберудің күрт төмендеуін және 505 нанометрдің сол жағындағы максималды шағылыстыруды көрсетеді, бірақ әлі де 505 нм-ден төмен кейбір беріліс болуы мүмкін.
Ұзын және жолақты өту сүзгілерінің айырмашылығы неде?
Флуоресценция сүзгілерін екі түрге бөлуге болады: ұзын өту (LP) және жолақты өту (BP).
Ұзын өту сүзгілері ұзын толқын ұзындығын жібереді және қысқаларын блоктайды. Кесілген толқын ұзындығы 50% максималды беру кезіндегі мән болып табылады және кесуден жоғары барлық толқын ұзындықтары ұзын өту сүзгілері арқылы беріледі. Олар дихроикалық айналар мен эмиссиялық сүзгілерде жиі қолданылады. Қолданба максималды шығарындыларды жинауды қажет еткенде және спектрлік дискриминация қажет емес немесе қажет болмаған кезде ұзақ өту сүзгілерін пайдалану керек, бұл әдетте фондық автофлуоресценцияның салыстырмалы түрде төмен деңгейлері бар үлгілерде бір сәуле шығару түрін тудыратын зондтарға қатысты.
Жолақты өту сүзгілері тек белгілі бір толқын ұзындығы жолағын жібереді, ал басқаларын блоктайды. Олар флюорофор сәулелену спектрінің ең күшті бөлігін ғана беруге мүмкіндік беру арқылы айқаспалы сөйлесуді азайтады, автофлуоресценция шуды азайтады және осылайша ұзақ өту сүзгілері ұсына алмайтын жоғары фондық автофлуоресценция үлгілеріндегі сигнал-шуыл қатынасын жақсартады.
BestScope флуоресценция сүзгілерінің қанша түрін бере алады?
Сүзгілердің кейбір кең таралған түрлеріне көк, жасыл және ультракүлгін сүзгілер жатады. Кестеде көрсетілгендей.
| Сүзгілер жинағы | Қозу сүзгісі | Дихрикалық айна | Кедергі сүзгісі | Жарықдиодты шам толқын ұзындығы | Қолданба |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485нм | ·FITC: Флуоресцентті антиденелер әдісі · Қышқылды апельсин: ДНҚ, РНҚ · Аурамин: туберкулез таяқшасы ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535нм | ·Родамин, TRITC: Флуоресцентті антиденелер әдісі · Пропидий йодид: ДНҚ · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365нм | ·Автофлуоресцентті бақылау ·DAPI: ДНҚ бояуы ·Hoechest 332528, 33342: хромосомаларды бояу үшін қолданылады |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405нм | · Катехоламиндер ·5-гидрокситриптамин · Тетрациклин: Қаңқа, тіс |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640нм | ·Cy5 · Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Флуоресценцияны алуда қолданылатын сүзгі жиынтықтары ең көп қолданылатын флуорофорларға негізделген флуоресценция қолданбаларында қолданылатын негізгі толқын ұзындықтары бойынша жасалған. Осы себепті, олар DAPI (көк), FITC (жасыл) немесе TRITC (қызыл) сүзгі текшелері сияқты бейнелеуге арналған флюорофордың атымен аталады.
| Сүзгілер жинағы | Қозу сүзгісі | Дихрикалық айна | Кедергі сүзгісі | Жарықдиодты шам толқын ұзындығы |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485нм |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365нм |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535нм |
| FL-Аурамин | BP470 | DM480 | BA485 | 450нм |
| Техас қызыл | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560нм |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560нм |
Флуоресцентті сүзгіні қалай таңдауға болады?
1. Флуоресценция сүзгісін таңдау принципі ең жоғары сигнал/шу қатынасын алу үшін флуоресценция/шығару жарығы кескіндеу ұшы арқылы мүмкіндігінше өтуге мүмкіндік беру және қоздыру жарығын бір уақытта толығымен блоктау болып табылады. Әсіресе мультифотонды қозуды және толық ішкі шағылыстыратын микроскопты қолдану үшін әлсіз шу да бейнелеу әсеріне үлкен кедергі келтіреді, сондықтан сигнал мен шу қатынасына қойылатын талап жоғарырақ.
2. Флюорофордың қозу және сәуле шығару спектрін білу. Қара фонмен жоғары сапалы, жоғары контрастты кескінді жасайтын флуоресцентті сүзгілер жинағын құру үшін қоздыру және эмиссия сүзгілері флюорофор қоздыру шыңдарына немесе шығарындыларына сәйкес келетін аймақтарда минималды өткізу жолағы толқындарымен жоғары беріліске қол жеткізуі керек.
3. Флуоресцентті сүзгілердің беріктігін қарастырыңыз. Бұл сүзгілер «күйіп қалуға» әкелетін ультракүлгін (УК) сәулені тудыратын қарқынды жарық көздерін өткізбейтін болуы керек, әсіресе қоздырғыш сүзгісі жарықтандыру көзінің толық қарқындылығына ұшырайды.
Әртүрлі флуоресцентті үлгі кескіндері
Ресурстар Интернетте жинақталған және ұйымдастырылған және тек оқу және қарым-қатынас үшін пайдаланылады. Егер қандай да бір бұзушылық болса, жою үшін бізге хабарласыңыз.
Жіберу уақыты: 09 желтоқсан 2022 ж